Прощай, простуда: внедрение препаратов в «карманы» вирусов

За окном светит яркое солнце, воздух наполнен теплой влагой, а спасительный прохладный ветерок решил взять отпуск, оставив нас на растерзание жары. Хочется джинсы сменить на шорты, ноутбук на волейбольный мяч, а офис на пляж. Лето ассоциируется с отпусками и каникулами, но порой в этот праздный перечень втискивается гость, которого мы обычно ждем в зимние месяцы, а именно простуда. Нет ничего хуже температурить, когда температура воздуха около 30. ОРВИ летом превращают человека в улитку, медленно плетущуюся по раскаленному асфальту, оставляя за собой склизкий след.

Может ли спасительная наука помочь нам в борьбе с риновирусами, спросите вы? Конечно может, ответят вам ученые, обнаружившие новый способ борьбы с рино-/энтеровирусами сокрытый в ранее неисследованном «кармане» вируса. Что это за карман, что в него хотят засунуть ученые и как это поможет победить риновирусы? Ответы мы найдем в докладе исследовательской группы.

Основа исследования

Для начала быстренько вспомним от чего у нас возникает ОРВИ и что это вообще такое.


Визуализация риновируса.

ОРВИ, то есть острая респираторная вирусная инфекция, это результат активной деятельности вируса в организме человека, а именно в его дыхательной системе. К таким вирусам относят риновирусы из рода энтеровирусов. Одной из основных структурных особенностей риновируса является открытый вирион, то есть вирусная частица без оболочки.

У человека риновирусы вызывают воспалительные процессы верхних дыхательных путей, ибо предпочитают размножаться в слизистой оболочке, покрывающей носоглотку. Симптоматика в случае инфицирования достаточно стандартная и всем знакомая — температура, насморк, болевой синдром в области гортани. В случае отсутствия лечения и пониженной иммунной ответной реакции организма ОРВИ может перерасти в бронхит, синусит или отит.

Можно ли лечить риновирусы и/или сделать прививку от них? Теоретически можно, но практически невозможно, так как число серологических вариантов возбудителя очень велико. Лечение риновирусных инфекций осуществляется путем ослабления симптоматики, а сам вирус побеждает иммунная система.

Если же говорить про лечение вирусной инфекции как таковой, то стоит понять сам процесс уничтожения вируса. Как правило, это осуществляется посредством внедрения в него лекарственного препарата, грубо говоря. На данный момент самыми изученными ингибиторами являются капсидные связующие, которые помещаются в гидрофобный карман вирусного капсида.

В рассматриваемом нами сегодня исследование ученые выявили ранее неизвестный карман, который формируется вирусными белками VP1 и VP3 и является общей чертой для разных видов энтеро-/риновирусов. Внедрение лекарства в этот карман позволит стабилизировать ключевую область вириона, что предотвратит конформационное расширение, необходимое для высвобождения вирусной РНК. Следовательно, никаких соплей, кашля и температуры. Согласитесь, звучит очень воодушевляюще.

Результаты исследования

Изображение №1

Ученые установили, что соединение 17 (1а), являющееся производным бензолсульфонамида, это достаточно мощный ингибитор для B3 штамма вируса Коксаки. Полумаксимальная эффективная концентрация (EC50) составляет 0.7 ± 0.1 мкМ (1b).

Соединение 17 также ингибирует репликацию CVB1 и CVB6, проявляет умеренную активность против CVB4, CVB5 и вируса Коксаки А9 (CVA9), но не реагирует против CVB2 даже при самой высокой протестированной концентрации (1b). Также данное соединение не ингибируется в CVA16 и EVA71 (группа EV-A), CVA21 и PV1 (группа EV-C), EVD68 (группа EV-D) и риновирусе B14 (RVB14, RV-B).

Противовирусная активность соединения 17 была дополнительно подтверждена в анализе вирусной нагрузки, в котором оно уменьшало дозозависимым образом образование РНК вирусов CVB3 и CVB3 со значениями ЕС50 0,4 ± 0,01 мкМ и 1,1 ± 0,3 мкМ соответственно (1с).

Соединение 17, как и плеконарил (противовирусный препарат), нацеливается на репликацию CVB3 на ранней стадии вирусного цикла. В случае внедрения соединения 17 спустя 2 часа после заражения противовирусная активность сильно снижается (1d).

Ученые напоминают нам, что ингибиторы энтеровирусов ранней стадии (например, плеконарил) взаимодействуют с вирусными капсидами и повышают их устойчивость к тепловой инактивации. Соединение 17 повысило термостабильность CVB3 на 1,5 при температуре 46˚C и на 2,1 при 49˚C (1е).

Если же объединить соединение 17 и плеконарил, то будет наблюдаться синергетическая противовирусная активность. То есть эти два вещества обладают разными механизмами противовирусного действия (1f).

Данные наблюдения позволяют сделать вывод, что соединение 17 достаточно хорошо подходит для проведения тестов, связанных с обнаруженным карманом в вирусном капсиде.

Дабы лучше рассмотреть процесс взаимодействия соединения 17 и вирусного капсида CVB3 ученые провели криоэлектронную микроскопию.


Изображение №2

Боковые цепи капсидного белка были легко идентифицированы, и модель гомологии CVB3 Nancy могла бы легко вписаться в карту уплотнений. Кроме того, крио-ЭМ штамма Nancy показал отсутствие уплотнения липидного фактора в гидрофобном кармане VP1. Тем не менее, анализ различий выявил дополнительное уплотнение, которое можно связать с атомарной моделью соединения 17 (2а, 2с).

Как видно на изображении 2b, компаунд имеет L-образную форму с длинным и коротким плечом, что позволяет реализовать «стыковку» с соединением 17. Моделирование показало, что соединение 17 связывается в кармане посредством двух блоков VP1 и одного блока VP3 на межпротомерном интерфейсе. Ввиду икосаэдрического типа симметрии вируса в одном каспиде может быть 60 таких областей (2с).

Рассматриваемая область находится на расстоянии в 16 Å от гидрофобного кармана, на который нацелен плеконарил. Таким образом, соединение 17 работает не там же, где и плеконарил, то есть не мешая его противовирусной активности, а дополняя ее.

Ученые провели моделирование взаимодействий внутри белков, интерфейсов, структур и соединений, которое показало остатки VP1 (73, 75–78, 155–157,159–160, 219 и 234) и VP3 (233–236), которые формируют карман (2d и 2e).

Анализ консервации этих карманных остатков в 56 аминокислотных последовательностях CVB3 показал, что 7 из 16 полностью консервированы (т.е. внутри есть соединение 17), а примерно 14 остатков показывали результат в 97% консервации. Консервация кармана также происходит и во всех энтеровирусах группы В.

Однако далеко не все вирусы так просто поддаются ингибированию соединением 17. Посему необходимо было понять, что делает их такими устойчивыми. Для этого ученые провели клоновую селекцию, выделив 4 мутации устойчивости. Три из четырех аминокислотных мутаций были расположены в непосредственной близости от кармана (F76C, E78G и A98V), и еще одна (D133G) была достаточно отдалена.


Степень влияния соединения 17, рупинтривира (ингибитор 3C-протеазы) и TP0219 (глутатион-истощающего соединения) на репликацию CVB3 WT и модифицированные CVB3 варианты.

Ученые подготовили 12 мутантов CVB3 в клоне CVB3 посредством обратного инжиниринга. Также был создан глутатион-независимый вариант VPB1_T77M CVB3, устойчивый к глутатион-истощающему соединению TP0219.

Лишь восемь из 12 мутантов оказались жизнеспособными (2d), 7 из них оказались устойчивыми к соединению 17 и одинаково реагируют на рупинтривир.

Исследование единственной отдаленной от кармана резистентной мутации продемонстрировало, что VP1_D133G более устойчив к теплу, чем CVB3 Nancy, а соединение 17 все еще может его стабилизировать. То есть VP1_D133G является компенсаторной мутацией, а не мутацией, которая предотвращает привязку соединения 17.

А вот VP1_T77 участвовал в связывании глутатиона. Анализ показал, что глутатион-независимый вариант VP1_T77M CVB3 обладает пониженной чувствительностью к соединению 17. Также было установлено, что этиловый эфир глутатиона никак не влиял на противовирусную активность соединения 17 даже при самой высокой протестированной концентрации.

Далее ученые проверили степень потенциального влияния соединения 17 на связывание вирусных рецепторов. Для этого были использованы белок человеческого вируса Коксаки и рецептор аденовируса (hCAR), связанные в цепочку. Аффинность связывания CVB3 не снижалась в присутствии соединения 17 даже при самой высокой протестированной концентрации. Кроме того, соединение 17 было активным в отношении CD55-зависимого* энтеровируса B (E-11 вирус).

CD55 (фактор ускорения распада комплемента)* — мембранный белок, ингибитор системы комплемента.

Экспериментальные данные также подтверждаются и тем, что участки связывания рецептор Коксаки + вирус аденовируса и CD55 + CVB3 не пересекаются с карманом.

Таким образом, ученые установили, что соединение 17 прекрасно внедряется в карман капсида различных вирусов. Следующий этап исследования это проверка эффективности внедряемого в данный карман препарата.


Изображение №3

Во время этой проверки были использованы как коммерчески доступные вещества (соединения 20-50), так и изготовленные в лаборатории модификации — соединения 51-81.

Знания касательно активности соединения 17 позволили вычленить конкретные характеристики, необходимые для будущего препарата. Ученые проанализировали информацию из противовирусных анализов и использовали ее в синтезе более активных аналогов соединения 17.

Результатом синтеза стали аналоги, которые проявляли активность против ряда энтеровирусов: EV-B (CVB), EV-C (PV1 и CVA21), EV-D (EVD68), RV-A (RVA09, RVA59 и RVA63) и RV-B (RVB14) (3а). К сожалению, ни одно из созданных соединений не было активно против вирусов EVA (CVA16 и EVA71).


Соединения с максимальной потенциальной активностью относительно тех или иных вирусов.

Среди всех аналогов соединения 29 и 48 проявили активность против всех 6 протестированных CVB (вирусы Коскаси группы В). Соединение 48 полностью ингибировало репликацию PV1 при концентрации 144 мкМ. Против RV-A и RV-B противовирусную активность проявило соединение 77.

Как видно на изображении №3, форма новых молекул дополняет форму кармана. Ученые смогли установить четкое соотношение структура-свойство (химическая структура молекулы к ее биологической активности) из карбоксильной группы в положении R3, где атом водорода необходим для противовирусной активности, и в положении R2, где гидроксильная группа демонстрирует свою пользу для широкого противовирусного действия. Крио-EM структурирование показало, что существует комплементарность заряда между R3 и ингибированным остатком VP1_R234.

Совокупность результатов проведенных тестов говорит о достаточно высокой степени внедрения тестируемых соединений в карманы капсидов вирусов из различных групп.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых (тут или тут)

Эпилог

Подводя итоги, ученые выявили в структуре энтеровирусов карманы, которые можно заполнить лекарственными препаратами, предотвращающими распространение вируса или полностью его уничтожающими.

Главным героем стало соединение 17 и его модифицированные аналоги, которые проявили высокую степень активности против CVB3. Выявленные карманы достаточно схожи между собой в разных группах вирусов, что позволяет в дальнейшем разработать препараты широкого спектра действия.

Другими словами, вирусы, которые ранее никто не лечил, теперь можно будет легко побороть. Конечно, полагаться исключительно на иммунную систему человека — не самая здравая идея, учитывая ряд заболеваний и отклонений, которые могут нарушить ее работу, открывая двери в организм человека самым разным вирусам. Подобные исследования и разработки крайне важны в наше время, учитывая рост населения планеты и скорость урбанизации. А эти показатели очень сильно влияют на скорость распространения вирусных инфекций. К тому же, имея препарат, способный побороть вирус в корне, человеку не понадобится бороться с каждым симптомом по отдельности, то есть покупать кучу других лекарств (капли, спреи, таблетки, суспензии и т.д. и т.п.).

Ученые продолжат свою работу, сконцентрировав свое внимание на поиске соединений, которые будут максимально эффективны против максимально возможного числа вирусов. Нам остается только пожелать им удачи и, пока они не довели дело до конца, бороться с простудой своими силами.



Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?